1. Spektrofotometrenin Ölçüm Prensibi

Spektrofotometreler tarafından kullanılan temel ölçüm prensibi nispeten basit ve anlaşılması kolaydır. Bu içerikte, katı numuneler ve çözelti (sıvı) numuneleri için ayrı ayrı geçerli olan prensipler açıklanmaktadır:

(1) Katı Numuneler

Şekil 1'de gösterildiği gibi, ilk olarak ölçüm ışığı ışınının yoğunluğu I₀, numune seti olmadan ölçülür. Daha sonra numune, ölçüm ışığı ışınının yoluna yerleştirilir ve ışık demetinin numuneden geçtikten sonraki yoğunluğu ölçülür.  (1)
Transmittans (geçirgenlik) değerinin 100 ile çarpımı yüzde geçirgenliktir (%T)


Şekil 1. Katı Numunelerin Ölçüm Prensibi

(2) Çözelti (Sıvı) Numuneleri
Şekil 2’de gösterildiği gibi, içinde çözücü bulunan bir küvet, ışık yoluna yerleştirilir ve ışığın yoğunluğu, I₀ küvetinden geçtikten sonra ölçülür. Daha sonra, numunenin çözücü içinde çözülmesiyle oluşturulan çözeltiyi içeren bir küvet, ışık yoluna yerleştirilir ve ışığın küvetten geçtikten sonra yoğunluğu ölçülür.

Transmitans, t, değeri denklem (1) ile hesaplanır, ancak sıvı numuneler için, denklem (2) ile açıklanan absorbans, Abs değerinin kullanımı daha yaygındır.      (2)

Absorbans, Abs ve numune konsantrasyonu, C arasındaki ilişkiyi ifade eden denklem (3), “Lambert-Beer yasası”olarak adlandırılır.
Absorbans ve konsantrasyon arasında orantılı bir ilişki vardır ve bu kantitatif analizin temelini oluşturur.    (3)

Burada ε, numunenin absorpsiyon katsayısıdır ve L, küvetin optik yol uzunluğudur. Şekil 2'de gösterilen ölçüm yöntemi, küvet yüzeyinden yansıma ve çözücü tarafından absorpsiyonun etkisini ortadan kaldırır ve sadece numuneden kaynaklanan absorpsiyonun ölçülmesini sağlar.

Monokromatik ışık genellikle Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen ölçüm ışığı ışını için kullanılır. Monokromatik ışık, tek bir dalga boyundan oluşan ışıktır. Kesin olarak, spektral bir bant genişliğine (yarık genişliği) sahiptir. Örneğin, dalga boyu 500 nm ve spektral bant genişliği 2 nm olan monokromatik ışık, 499 ve 501 nm'yi kapsayan bir dalga boyu aralığını (maksimum yarıda tam genişlik) kapsayan ışıktır.


Şekil 2. Sıvı Numunelerin Ölçüm Prensibi

2. Spektrofotometrenin Yapısı

Yukarıdaki açıklamadan, bir spektrofotometrenin vazgeçilmez unsurlarının Şekil 3'te gösterildiği gibi bir ışık kaynağı, bir spektrometre, bir numune bölmesi ve bir dedektörden oluştuğunu göreceksiniz. Bir önceki bölümde numunenin monokromatik ışığa maruz kaldığını belirtmemize rağmen, spektrometreye geçmeden önce numuneden beyaz ışığın geçtiği cihazlar bulunmaktadır. Bu yöntem, dizi (array) dedektörleri kullanan yüksek hızlı fotometri cihazlarında kullanılır. Sonraki bölümlerde her bir öğenin açıklamasına yer verilecektir.

3. Işık Kaynağı 

Bir ışık kaynağının istenen özellikleri aşağıdaki gibidir:

1. Geniş bir dalga boyu aralığında parlaklık
2. Zaman içindeki kararlı olması
3. Uzun ömürlü olması
4. Düşük maliyetli olması

 
Tüm bu özelliklere sahip ışık kaynakları olmamakla birlikte şu anda en çok kullanılan ışık kaynakları, görünür ve kızıl ötesine yakın bölgeler için kullanılan halojen lambalar ve ultraviyole bölge için kullanılan döteryum lambalardır. Bunların dışında bazen ksenon flaş lambaları da kullanılmaktadır.


Şekil 3. Spektrofotometre Konfigürasyonu
 

(1) Halojen Lamba

Işık yayma prensibi, standart bir akkor ampulle aynıdır. Bir filamente elektrik akımı verilir, filament ısınır ve ışık yayılır. Halojen lambadaki ampul, inert gaz ve az miktarda halojen ile doldurulur. Filament olarak kullanılan tungsten yüksek sıcaklıktan dolayı buharlaşırken, halojenür tungstenin filamente dönmesine neden olur. Bu, uzun ömürlü parlak bir ışık kaynağı oluşturmaya yardımcı olur. Bir halojen lambanın emisyon yoğunluğu dağılımı Planck'ın radyasyon yasası kullanılarak tahmin edilebilir. Şekil 4, 3.000 K'lik bir sıcaklık için emisyon yoğunluğu dağılımını göstermektedir. Halojen lamba, üstüm geçici kararlılık, yaklaşık 2.000 saat kullanım ömrü ve nispeten düşük bir maliyet sağlar. Yukarıda bahsedilen a) ila d) özelliklerinin her birinin nispeten yüksek seviyelerine sahiptir.


Şekil 4. Halojen Lambanın Emisyon Yoğunluk Dağılımı
 

(2) Döteryum Lambası

Döteryum lambası, ampulün birkaç yüz paskal basınçta döteryum (D2) ile doldurulduğu bir deşarj ışık kaynağıdır. Şekil 5, döteryum lambası için emisyon yoğunluğu dağılımını göstermektedir. Genelde 400 nm, uzun dalga boyu ucunda yaklaşık bir kullanım limiti olmasına rağmen, bu uçtaki zayıflama derecesi oldukça düşük olduğundan, 400 nm'den büyük dalga boylarına sahip ışık kullanılır. 400 nm'nin ötesindeki bölgede, çok sayıda parlak çizgi spektrumları da vardır. Bunlar arasında, 486.0 nm ve 656.1 nm'deki parlak çizgi spektrumları özellikle yoğundur ve spektrofotometrelerin dalga boyu kalibrasyonu için kullanılabilir. Kısa dalga boyu ucundaki kullanım limiti, pencere malzemesinin geçirgenliği ile belirlenir. Şekil 5'te pencere malzemesi için sentetik silika ve UV camın kullanıldığı durumlara ait grafikler örnek olarak verilmiştir.


Şekil 5. Döteryum Lambanın Emisyon Yoğunluk Dağılımı
 

4. Monokromatör

Spektroskopi, çeşitli dalga boylarından oluşan ışığı, bu dalga boylarına karşılık gelen bileşenlere ayırma tekniğidir. Bu ışığı bölen öğeye dağıtıcı öğe denir. Prizmalar ve difraksiyon gratingleri (kırınım ızgaraları) tipik dağıtıcı unsurlardır. Prizmalar eskiden spektrometrelerde dağıtıcı elemanlar olarak kullanılırdı, ancak son zamanlarda difraksiyon gratingleri en yaygın kullanılan dağıtıcılar haline gelmiştir. Spektrofotometrelerde kullanılan difraksiyon gratingleri, eşit aralıklarla kesilen milimetre başına birkaç yüz ila yaklaşık 2.000 paralel oluğa sahiptir. Bir enine kesit örneği Şekil 6'da gösterilmektedir. Bu difraksiyon gratingleri, girişim nedeniyle beyaz ışığa maruz kalırsa, beyaz ışık oluklara dik bir yönde dağılır ve yalnızca belirli dalga boylarının ışık bileşenleri belirli yönlerde yansıtılır. Bu, Şekil 7'de gösterilmektedir. Λ1 ila λ3, dalga boylarını temsil eder. Dalga boyları sürekli olarak değişir ve bu nedenle bir difraksiyon gratingleri beyaz ışığa maruz kalırsa, yanardöner görünür. Bir CD'nin ışığa maruz kaldığında yanardöner bir şekilde parıldama şekli, bir difraksiyon gratingleri gerçekleştirilen spektroskopi ile aynı mekanizmaya dayanır.
Bir monokromatör, bir giriş yarığı (entrance slit), bir çıkış yarığı (exit slit) ve bir difraksiyon grating’inin yanı sıra aynalar ve bunlarla birlikte gelen diğer parçalardan oluşur. Elemanların düzenlemesine göre değişen çeşitli monokrometre tipleri tasarlanmış olmasına rağmen, Şekil 8, bir içbükey difraksiyon grating’i kullanan en basit monokromatör konfigürasyonunun bir örneğini göstermektedir. İçbükey difraksiyon grating’i döndürülerek, değişen dalga boylarındaki ışık çıkış yarığından yansıtılır.


Şekil 6. Difraksiyon Grating’inin Yan Kesiti


Şekil 7. Işığın Difraksyon Grating’i ile Saçılımı


Şekil 8. İçbükey Grating’li bir Spektrofotometrenin Grafik Gösterimi

5. Numune Kompartımanı

Şekil 9, standart bir numune kompartımanının (bölmesinin) bir örneğini göstermektedir. İki ışık demetinin (Şekil 9'da kırmızı oklarla gösterilen) bölmeden geçtiğini ve bu nedenle bunun bir "çift ışınlı (double-beam) spektrofotometre" cihazının numune bölmesi olduğunu görebilirsiniz. Spektrometreden çıkan tek renkli ışık, numune bölmesine girmeden önce iki ışına bölünür. Numune bölmesinden yalnızca bir ışının geçtiği bir spektrofotometre "tek ışınlı spektrofotometre" olarak adlandırılır.
Standart bir konfigürasyonda, numune bölmesi, Şekil 9'da gösterildiği gibi, optik yol uzunlukları 10 mm olan kare küvetleri tutan küvet tutucuları içerir. Bu küvet tutucu birimleri değiştirilerek veya tüm numune bölmesi değiştirilerek çeşitli aksesuarlar takılır. Daha sonra dedektör olarak tanımlanacak olan, fotomultipler kullanan orta veya daha yüksek sınıftaki spektrofotometreler arasında, büyük numunelerin analizine veya büyük aksesuarların takılmasına olanak vermek için geniş numune bölmelerinin bulunduğu modeller bulunmaktadır.


Şekil 9. Numune Kompartımanı
 

6. Dedektör

Numune bölmesinden geçen ışık demetleri, spektrofotometrenin son bölümü olan dedektöre girer. Fotoçoğaltıcılar ve silikon fotodiyotlar, morötesi ve görünür bölgeler için spektrofotometreler ile kullanılan tipik dedektörlerdir. Yakın kızılötesi bölge için, geçmişte her zaman PbS foto iletken elemanlar kullanılmıştır, ancak son zamanlarda, InGaAs fotodiyotlarını içeren cihazlar da yaygınlaşmaktadır. Silikon fotodiyot array dedektörler, yüksek hızlı fotometri cihazları için tersine spektroskopi yöntemiyle birlikte kullanılır. Fotoçoğaltıcılar ve silikon fotodiyotlar aşağıda açıklanmaktadır.

(1) Fotoçoğaltıcı

Bir fotoçoğaltıcı, ışığa maruz kaldığında fotoelektronların bir fotoelektrik yüzeyden boşalması prensibine (harici fotoelektrik etki) dayalı bir dedektördür. Fotoelektrik yüzeyden yayılan fotoelektronlar, ardışık olarak düzenlenmiş dinodlarda tekrar tekrar ikincil elektron emisyonuna neden olur ve sonuçta nispeten küçük bir ışık yoğunluğu için büyük bir çıktı üretir. Bir fotoçoğaltıcının en önemli özelliği, diğer optik sensörlerle elde edilemeyen önemli ölçüde yüksek bir hassasiyet seviyesine ulaşmasıdır. Yeterli ışık yoğunluğu varsa, bu özellik çok gerekli değildir, ancak ışık yoğunluğu azaldıkça bu özellik giderek daha kullanışlı hale gelir. Bu nedenle fotoçoğaltıcılar yüksek kaliteli cihazlarda kullanılmaktadır. Bir fotoçoğaltıcının spektral hassasiyet özellikleri esas olarak fotoelektrik yüzeyin malzemesi tarafından belirlenir. Şekil 10, spektrofotometrelerde sıklıkla kullanılan bir yüzey türü olan çok alkali bir fotoelektrik yüzeyin spektral hassasiyet özelliklerinin bir örneğini göstermektedir.


Şekil 10. Bir Fotoçoğaltıcının Spektral Hassasiyet Özellikleri

(2) Silikon Fotodiyot

Bir silikon fotodiyot, bir dedektörün elektriksel özelliklerinin ışığa maruz kaldığında değişmesi prensibine (dahili fotoelektrik etki) dayalı bir dedektördür. Son zamanlarda çok ilgi gören güneş pilleri, silikon fotodiyotlarla aynı yapı ve prensibi kullanmaktadır. Fotoçoğaltıcılara kıyasla silikon fotodiyotlar, düşük maliyet, ışık alan yüzeyde az hassasiyet yeri ve özel bir güç kaynağına ihtiyaç duyulmaması gibi avantajlar sunar. Hassasiyetle ilgili olarak bile, ışık yoğunluğu nispeten büyükse, fotomultipleyiciler ile elde edilenden daha düşük olmayan fotometrik veriler elde edebilirler. Şekil 11, bir silikon fotodiyotun spektral duyarlılık özelliklerinin bir örneğini göstermektedir.


Şekil 11. Bir Silikon Fotodiyodun Spektral Hassasiyet Özellikleri
 
Referans
C101-E111 Shimadzu UV Talk Letter Vol. 2, February 2009