Western Blot Islak, Yarı Kuru ve Kuru Transfer Yöntemleri

(Wet Transfer, Semi-Dry Transfer, Dry Transfer)

Jelden lekeleme zarına verimli ve güvenilir protein transferi, başarılı bir western saptama deneyinin temel taşıdır. Sonuçların doğruluğu western blot yönteminin transfer verimliliğine bağlıdır. Geleneksel ıslak transfer, yüksek verimlilik sunar, ancak zaman ve emek pahasına. Yarı kuru kurutma, çok sayıda tampon sistemi veya tampon içermeyen önceden birleştirilmiş yığınları kullanma esnekliği ile kolaylık ve zaman tasarrufu sağlar.
Bununla birlikte, yarı-kuru transfer, büyük moleküler ağırlıklı proteinlerin (>300 kDa) transferinde daha düşük bir verimliliğe sahip olabilir. Kuru elektroblotlama, kuru elektroblotlama için ilave tamponlar gerekli olmadığından, hem hız hem de kolaylık ile birlikte yüksek kaliteli transfer sunar.

Proteinleri SDS-PAGE veya doğal jellerden nitroselüloz, PVDF veya naylon membranlara üretimin üç ana yolu:

• Islak tank elektrotransferi
• Yarı kuru elektrotransfer
• Kuru elektrotransfer

Islak Tank Elektrotransferi (Wet Tank Transfer)

Islak transfer gerçekleştirildiğinde, jel ilk önce transfer tamponunda dengelenir. Jel daha sonra "transfer sandviçine" (filtre kağıdı-jel-membran-filtre kağıdı) yerleştirilir, pedlerle tamponlanır ve bir destek ızgarası ile birbirine bastırılır. Desteklenen jel sandviç, paslanmaz çelik/platin tel elektrotlar arasındaki bir tanka dikey olarak yerleştirilir ve transfer tamponu ile doldurulur.

Sabit akımda (0,1 ila 1 A) veya voltajda (5 ila 30 V) 1 saat gibi kısa bir süreden bir geceye kadar gerçekleştirilen standart alan seçeneğinde çoklu jeller elektro transfer edilebilir. Transferler tipik olarak bir buz paketi ile ve üretilen ısıyı azaltmak için 4°C'de gerçekleştirilir. Tek bir jel için transfer süresini 30 dakikaya kadar indirebilen yüksek alan seçeneği mevcuttur, ancak üretilen muazzam ısıyı dağıtmak için yüksek voltaj (200 V'a kadar) veya yüksek akım ve bir soğutma sistemi kullanılmasını gerektirir. .













 

Western blotlama için tank transfer aparatı. Elektrot pozisyonuna göre jelin konumu, transfer membranı ve protein yönü ile tipik bir western blot aparatının montajını gösteren şema.

14-116 kDa arasındaki proteinler için %80-100 arası transfer verimliliği elde edilebilir. Aktarım verimliliği, artan aktarım süresi ile artar. Bununla birlikte, artan zamanla, özellikle daha büyük gözenek boyutuna (0.45 µm) sahip zarlar kullanıldığında, özellikle daha düşük moleküler ağırlıklı (<30 kDa) proteinler için proteinlerin zardan aşırı transfer (patlama) riski vardır.

Yarı Kuru Elektrotransfer (Semi-Dry Transfer)

Yarı kuru protein transferi için, transfer sandviçi yarı kuru transfer aparatında iki plaka elektrotu arasına yatay olarak yerleştirilir. Bu yarı kuru transfer için jelin transfer tamponunda önceden dengelenmesi çok önemlidir. Jelin etrafından geçmek yerine jelden geçen akımı maksimize etmek için, transfer sırasında mevcut tampon miktarı sandviçte bulunanla sınırlıdır, bu nedenle ekstra kalın filtre kağıdı (~3 mm kalınlık) ve membranın olması yararlıdır. ayrıca tamponda yeterince ıslatılmış. Aynı şekilde, filtre kağıdı tabakalarının ve membranın jel boyutunda kesilmesi de önemlidir.

Bir ila dört jel hızla membranlara elektroblotlanabilir. Transfer tamponuna metanol dahil edilebilir, ancak aromatik hidrokarbonlar, klorlu hidrokarbonlar ve aseton dahil olmak üzere diğer organik çözücüler, yarı kuru kurutma kağıdına zarar vermemek için kullanılmamalıdır. Elektrotransfer, 10 ila 60 dakika boyunca sabit akımda (0,1 ila ~0,4 A) veya voltajda (10 ila 25 V) gerçekleştirilir. Transfer süresini 7 ila 10 dakikaya düşürmek için metanol içermeyen transfer tamponları önerilir. 14 ila 116 kDa arasındaki proteinler için %60 ila %80'lik aktarım verimleri elde edilebilir, daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri aktarmak için daha uzun aktarım süreleri gerekir.

 

Yarı kuru elektroblotlama transferi. Invitrogen Power Blotter, 10-300 kDa proteinlerin poliakrilamid jellerden nitroselüloz veya PVDF membranlara 5-10 dakika içinde hızlı yarı kuru transferi için özel olarak tasarlanmıştır. Power Blotter, yaygın olarak kullanılan prekast veya ev yapımı jeller (SDS-PAGE) ve nitroselüloz veya PVDF membranlarla kullanıldığında tutarlı, yüksek verimli protein aktarımı sağlamak için optimize edilmiş entegre bir güç kaynağına sahiptir.

Kuru Elektrotransfer (Dry Transfer)

Kuru elektroblotlama yöntemleri, geleneksel transfer tamponlarının kullanımını ortadan kaldıran yenilikçi bileşenler içeren özel bir transfer sandviçi kullanır. Tampon tankları veya ıslatılmış filtre kağıtları yerine tampon içeren benzersiz bir jel matrisi (transfer yığını) kullanılır. Jel matrisindeki yüksek iyon yoğunluğu, hızlı protein transferini sağlar. Lekeleme sırasında, bakır anot, su elektrolizi sonucunda oksijen gazı üretmez, bu da leke bozulmasını azaltır. Islak ve yarı kuru dahil olmak üzere geleneksel protein transfer teknikleri, oksijen üreten inert elektrotlar kullanır. Tipik olarak, elektrotlar arasındaki kısaltılmış mesafe, yüksek alan gücü ve yüksek akım ile aktarım süresi azalır.










 

Kuru elektroblotlama transferi. Invitrogen iBlot 2 Kuru Blot Sistemi, arabelleklere ihtiyaç duymadan batıya hızlı transfer sağlar. Bu sistem, akrilamid jellerdeki proteinleri 7 dakika veya daha kısa sürede verimli bir şekilde blotlar ve hem PVDF hem de nitroselüloz membranlarla uyumludur. iBlot 2 Sistemi, çok kısa sürede geleneksel ıslak transfer yöntemleriyle karşılaştırılabilir bir performansa sahiptir.

Yarı kuru elektroblotlama transferi. Invitrogen Power Blotter, 10-300 kDa proteinlerin poliakrilamid jellerden nitroselüloz veya PVDF membranlara 5-10 dakika içinde hızlı yarı kuru transferi için özel olarak tasarlanmıştır. Power Blotter, yaygın olarak kullanılan prekast veya ev yapımı jeller (SDS-PAGE) ve nitroselüloz veya PVDF membranlarla kullanıldığında tutarlı, yüksek verimli protein aktarımı sağlamak için optimize edilmiş entegre bir güç kaynağına sahiptir.